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本方法适用于保健食品营养补充剂中维生素B12(cyanocobalamin)的测定。
本方法检出限为4ng。
* 想了解什么是维生素B12 ?
1．方法提要 目前维生素B12的国家标准检测方法是微生物法，相对较繁琐，而强化在保健食品中的维生素B12含量较微，本法用高效液相色谱仪C18柱对保健食品中维生素B12在达到检测限的条件下进行分离，紫外检测，以外标法定量。
2．仪器 (1)高效液相色谱仪、紫外检测器。
(2)超声波提取器。
3．试剂 (1)乙腈：色谱纯。
(2)超纯水：双蒸水经Milli—Q型纯水器过滤。
(3)维生素B12标准品：Sigma公司，含量99％。
准确称取维生素B12标准品16．5mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，为165．0μg／ml标准贮备液。精密量取1ml，置100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，为1．65μg／ml，再依次对倍稀释成0．825μg／ml、0．413μg／ml、0．206μg／ml、0．103μg／ml标准使用液。
4．测定步骤 (1)胶囊和片剂样品：准确称取经研磨并充分均匀的样品粉末适量(含维生素B12 5～10μg)，置于20～50ml容量瓶中，加2／3体积的超纯水，超声波提取15min，冷却后加水至刻度，精滤后于HPLC进样测定。保健食品中维生素B12 含量一般较低，如采样量大，可置50ml离心管中，用单标定量移液管准确加入50ml纯水，超声波提取15min，再高速离心10min，精滤后于HPLC进样测定。
(2)液体样品：对颜色较浅的液体样品，精滤后可直接进样。对糖浆类或颜色较深的样品，可取适量(含维生素B12 5～10μg)置于20～50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精滤后于HPLC进样测定。
(3)标准曲线绘制：标准使用液各点分别在高效液相色谱仪中进样测定，并记录相应的峰面积，绘制标准曲线。
(4)色谱条件
色谱柱：Henomenegemini C18，250mm×4．6mm，5μm。
流动相：A为水，B为乙腈。梯度洗脱：0～11min：14％B；11～12min：14％～80％B；12～17min：80％B；17～19min：80％．2％B；19～27min：2％B；27～28min：2％～14％B；28～35min：14％B；35min：停止。
检测波长：361nm。
进样量：100μl。流速：1ml／min。
5．结果计算 X=(c×V×100)/m
式中X——样品中维生素B12含量[μg／100g(ml)]；
c——从标准曲线查得样液中维生素B12的浓度(μg／ml)；
V——样品液定容体积(ml)；
m——样品质量(g或ml)。
6．注释 (1)保健食品中维生素B12的强化量较微，高效的色谱柱分离条件及有代表性的采样和达到检测限的进样量是检出成功的关键，本方法流动相为梯度洗脱，能有效地排除检样中其他维生素及矿物质和微量元素的干扰，根据实验室条件，适当调节比例使维生素B12的出峰时间控制在10min为宜，并同时做辅料的阴性确证实验。
(2)本方法线性范围为0．103～1．650μg／ml，Y=115678x+475．31，r=1。
(3)本方法平均回收率为93．4％，RSD为1．43％(n=9)。
(4)精密度RSD为1．3％(n=9)。
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